с чем связана кислотоустойчивость микобактерий при окраске

С чем связана кислотоустойчивость микобактерий при окраске

ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии»; Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

Санкт-Петербургскогий государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Информативность различных методов идентификации кислотоустойчивых микобактерий в зависимости от степени активности туберкулезного процесса

Журнал: Архив патологии. 2018;80(3): 40-45

Цинзерлинг В. А., Агапов М. М., Орлов А. Н. Информативность различных методов идентификации кислотоустойчивых микобактерий в зависимости от степени активности туберкулезного процесса. Архив патологии. 2018;80(3):40-45.
Tsinzerling V A, Agapov M M, Orlov A N. The informative value of various methods for identifying acid-fast bacilli in relation to the degree of tuberculosis process activity. Arkhiv Patologii. 2018;80(3):40-45.
https://doi.org/10.17116/patol201880340-45

ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии»; Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии»; Медицинский факультет Санкт-Петербургского университета

Санкт-Петербургскогий государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии

Морфологические методы выявления микобактерий туберкулеза (МБТ) незаменимы в рутинной практике фтизиатрических, инфекционных и многопрофильных стационаров, дополняя клинические, радиологические, микробиологические и иммунологические подходы. При этом число микобактерий, обычно оцениваемое по количеству кислотоустойчивых палочек при окраске по Цилю—Нильсену (Ziehl—Neelsen), часто не соответствует активности инфекционного процесса как по клиническим, так и морфологическим данным, что, однако, не послужило пока предметом масштабных исследований [1, 2].

Основным, используемым с конца XIX века, методом окрашивания микобактерий является метод Циля—Нильсена с использованием карболового фуксина. Состав красителя и протокол окрашивания варьируют в модификациях разных авторов, но суть метода неизменна: карболовый фуксин задерживается в клеточной стенке микобактерий и сохраняется в ней даже после обработки кислотой, обесцвечивающей все остальные структуры и микроорганизмы.

Альтернативным методом селективного окрашивания МБТ является использование раствора аурамина О и родамина В, предполагающее исследование ткани с применением люминесцентной микроскопии, что ограничивает его широкое использование. Как и карболовый фуксин, аурамин образует комплекс с миколовыми кислотами в составе микобактерий, но, по-видимому, обладает к ним большим сродством, поэтому правильно окрашенные препараты с полноценно обесцвеченным фоном обеспечивают высокую контрастность микобактерий и позволяют обнаруживать их в большем количестве по сравнению с окраской по Цилю—Нильсену [3, 4].

Обсуждается возможность выявления МБТ в тканях при использовании иммуногистохимии (ИГХ) и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применительно к ИГХ проблемой является перекрестная чувствительность антител как к микобактериям туберкулезного комплекса, так и к нетуберкулезным микобактериям. Применение метода ПЦР существенно ограничивают значительные технические трудности, связанные с его проведением, а также отсутствие возможности достоверного определения количества возбудителей и их локализации [5—8].

В качестве сыворотки для ИГХ-исследования используются моноклональные антитела к антигену РАВ (Protein antigen B)—гликопротеину с молекулярной массой 38 кДа, обнаруживаемому вне зависимости от состояния клеточной стенки микобактерий [9].

Неоднородность результатов даже при правильно выполненной классической окраске по Цилю—Нильсену может рассматриваться как повод для изучения свойств возбудителя.

Одним из важных факторов, влияющих на взаимодействие МБТ с макроорганизмом, является иммуносупрессия прежде всего при ВИЧ-инфекции, в результате чего морфологическая картина туберкулеза в большинстве случаев становится нетипичной за счет меньшей выраженности гранулематозной реакции и большей альтерации, при этом число обнаруживаемых кислотоустойчивых палочек, как правило, больше [10]. Тем не менее и у пациентов без иммуносупрессии регулярно встречается ситуация, при которой ожидаемая с учетом клинических данных морфологическая картина далека от классических представлений о строении туберкулезной гранулемы, локализации и форме кислотоустойчивых микобактерий [11—14].

Слабое окрашивание карболовым фуксином или полное отсутствие такового, зачастую безосновательно трактуемое как технологический дефект, в действительности может быть связано с изменением самого возбудителя, предполагающим полную или частичную утрату микобактериями клеточной стенки (возможно, по типу образования L-форм), чей химический состав и пространственная структура определяют их тинкториальные свойства. Трансформация в L-формы является универсальным свойством многих видов бактерий, обеспечивающих адаптацию в неблагоприятных условиях [15]. В случае с МБТ в качестве неблагоприятных условий можно рассматривать как иммунный ответ, так и специфическую терапию. Показано, что потеря клеточной стенки может быть одним из факторов формирования лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам [16, 17].

Кроме непостоянства тинкториальных свойств микобактерий, также требует изучения феномен, при котором обнаруживаются атипичные формы возбудителя: кокковидные, булавовидные, ветвящиеся и прочие, отличные от классических палочек Коха [18].

Образование подобных форм может происходить как в процессе изменения структуры клеточной стенки, так и в результате изменения жизненного цикла причем и при ускорении размножения, и при его угнетении с преобладанием старых форм. В любом случае атипичная морфология микобактерий требует сопоставления с клиническими проявлениями заболевания и эффективностью терапии [19—22].

Материал и методы

Изучены 24 случая аутопсии клинически, рентгенологически и микробиологически верифицированного фиброзно-кавернозного туберкулеза легких. Большинство пациентов мужчины, средний возраст 49,67±5,77 года. У большей части пациентов зафиксирована широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) МБТ — 14 случаев либо множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) МБТ — 5 случаев (невосприимчивость заболевания соответственно к четырем или двум противотуберкулезным препаратам первой линии), при этом ни в одном случае не выявлено сочетания туберкулеза с ВИЧ. Во всех наблюдениях имело место длительное течение заболевания и продолжительное лечение в профильных стационарах (см. таблицу). Характеристика исследованных умерших Примечание. М — мужчины, Ж — женщины.

Непосредственной причиной смерти большинства пациентов стала интоксикация вследствие прогрессирования инфекционного процесса, также были зафиксированы случаи смерти от легочного кровотечения, тромбоэмболии легочной артерии и сердечно-легочной недостаточности. На вскрытии диагноз фиброзно-кавернозного туберкулеза во всех случаях подтвержден.

Кусочки легких для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой в спиртах и заливкой в парафин по общепринятым методикам. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, карболовым фуксином по Цилю—Нильсену, аурамин-родамином (с последующим исследованием с помощью люминесцентного микроскопа), также проводили ИГХ-исследование с использованием моноклональных антител к антигену РАВ.

Исследование включало оценку выраженности морфологических изменений в области каверн и активности туберкулезного процесса по классификации Б.М. Ариэля [23], подсчет количества микобактерий при увеличении в 400 раз и количества полей зрения, в которых они визуализируются, определение соотношения между различными морфологическими формами возбудителя (палочковидными, кокковидными и прочими), а также их локализация (внутриклеточно, внеклеточно либо в виде адгезированных на поверхности фагоцитов).

После оценки процентного соотношения различных морфологических форм микобактерий подсчитывали среднее значение для каждой формы, затем вычисляли абсолютную погрешность с доверительной вероятностью p=0,95. Значимость различий между методами исследования оценивали путем вычисления t-критерия Стьюдента и сравнения с критическими значениями.

Результаты

При окраске гематоксилином и эозином во всех наблюдениях выявлены характерные для туберкулеза изменения, соответствующие прогрессированию инфекционного процесса (активность IV—V степени по классификации Б.М. Ариэля): крупные каверны с широкой фиброзной капсулой в стенках каверн и в окружающей легочной ткани, определялись гранулемы и более крупные очаги отсева, представленные округлыми эозинофильными фокусами казеозного некроза с мелкими фрагментами клеточного детрита различного размера, окруженными клеточным валом, представленным лимфоцитами, плазмоцитами и в большей степени макрофагами с эпителиоидно-клеточной трансформацией и тенденцией к слиянию с формированием единичных гигантских многоядерных клеток Лангерганса типичного строения с примесью единичных нейтрофильных гранулоцитов. В других полях зрения отмечали утолщение межальвеолярных перегородок за счет фиброза, дистелектазы, очаговый антракоз, умеренный интерстициальный и альвеолярный отек, паретическое полнокровие сосудов, очаговые диапедезные кровоизлияния. Бронхи малого и среднего размера характеризовались лимфоцитарной инфильтрацией, склерозом, гипертрофией мышечного слоя, очаговой атрофией мерцательного эпителия (рис. 1, 2). Рис. 2. Стенка каверны у пациента с фиброзно-кавернозным туберкулезом. Окраска гематоксилином и эозином, ×100. Рис. 1. Типичная картина туберкулезного воспаления. Окраска гематоксилином и эозином, ×100.

При окраске аурамин-родамином и последующем исследовании в люминесцентном микроскопе обнаруживали очаговые скопления внеклеточно расположенных микобактерий в 10—50 полях зрения общим числом от 1000 до 10 000, преимущественно палочковидных (50—85%, в среднем 64,38±4,24%), а также кокковидных (10—45%, в среднем 27,29±3,84%), гранул (2—10%, в среднем 6±1,09%), булавовидных (1—5%, в среднем 1,96±0,6%) и ветвящихся (до 1%) форм микобактерий (рис. 5, 6). Рис. 6. Палочковидные и атипичные формы микобактерий. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×1000. Рис. 5. Внеклеточно расположенные одиночные микобактерии и их скопления. Окраска аурамин-родамином. Люминесцентная микроскопия, ×400.

При ИГХ-исследовании (рис. 7, 8) Рис. 7. Множественные внеклеточные скопления микобактерий. ИГХ-исследование, ×400. Рис. 8. Атипичные морфологические формы микобактерий. ИГХ-исследование, ×1000. обнаруживали множественные скопления внеклеточно расположенных микобактерий более чем в 50 полях зрения общим числом более 10 000, характеризовавшихся большим разнообразием форм: на палочки приходилось 50—70% (в среднем 57,29±2,78%), на кокковидные — 20—39% (в среднем 28,71±2,31%), на гранулы — 5—13% (в среднем 9,04±1,04%), на булавовидные — 1—7% (в среднем 3,71±0,64%) и на ветвящиеся — 1—3% (в среднем 1,25±0,47%).

Обобщая полученные данные, можно сказать, что доля типичных палочек, выявленных посредством классической окраски по Цилю—Нильсену, значимо больше таковой (t=10,4; p≤0,05), выявленной при окраске аурамин-родамином, и еще более значимо (t=18,2; p≤0,05), чем при проведении ИГХ-исследования. Столь же сильно разнятся показатели для атипичных морфологических форм микобактерий, выявленных при окраске по Цилю—Нильсену в минимальном количестве и обнаруженных в большом количестве при флюоресцентном и ИГХ-исследовании.

Обсуждение

Несмотря на типичную картину активного туберкулезного поражения с большим объемом казеозных масс, окраска по Цилю—Нильсену не выявила многочисленных кислотоустойчивых бактерий, подтвердив встречаемый в практике феномен. Принципиально важным при этом является выбор для исследования именно пациентов с фиброзно-кавернозным туберкулезом, чей анамнез предполагал длительное волнообразное течение заболевания и продолжительную терапию, корректировавшуюся в ходе лечения, с учетом ее неэффективности вследствие устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам.

Такие случаи можно считать самыми сложными для классического бактериоскопического выявления МБТ ввиду предшествовавшего длительного процесса адаптации возбудителя, что сопровождалось периодами активации и угнетения размножения, а также изменением структуры клеточной стенки с сохранением вирулентности. Именно особенности жизненного цикла могут объяснить присутствие в большом количестве атипичных форм микобактерий, наиболее убедительно выявленных при ИГХ-исследовании.

Важно отметить отсутствие во всех наблюдениях (как при окраске по Цилю—Нильсену, так и при флюоресцентном исследовании) внутриклеточной локализации возбудителя. Микобактерии отсутствовали как в эпителиоидных клетках, макрофагах и в гигантских клетках Лангерганса, так и в нейтрофильных гранулоцитах. Наиболее информативным следует считать ИГХ-исследование, так как, если следовать теории, что явление дормантности возбудителя сопровождается полной или частичной потерей им клеточной стенки для последующей внутриклеточной персистенции, то отсутствие окрашивания внутриклеточно расположенных микобактерий карболовым фуксином по Цилю—Нильсену можно объяснить именно структурными изменениями клеточной стенки. Однако ИГХ-исследование не зависит от состояния и компонентов клеточной стенки, следовательно, обеспечивает выявление микобактерий, находящихся на любом этапе жизненного цикла, в том числе с изменением своих тинкториальных свойств.

В ходе ИГХ-исследования, как и в случае с окраской по Цилю—Нильсену и аурамин-родамином, не выявлено достоверных признаков присутствия возбудителя внутри фагоцитов, что идет вразрез с традиционными взглядами на локализацию микобактерий в туберкулезном очаге, сформированными на основе экспериментальных моделей заболевания у грызунов [24, 25]. В ряде наблюдений зафиксирована адгезия единичных микобактерий на поверхности макрофагов и нейтрофильных гранулоцитов. Не исключено, что подобное расположение способно симулировать внутриклеточную локализацию.

Необходимо отметить, что в обследованной группе у пациентов имелась определенная гетерогенность, связанная с возрастом, варьировавшим в пределах от 31 года до 84 лет, и длительностью заболевания (от 2 до 33 лет), однако морфологическая картина туберкулеза и характеристика микобактерий практически идентичны у всех пациентов вне зависимости от возраста и давности заболевания.

Принципиальным моментом также явилось расположение в ряде случаев скоплений МБТ по периферии очагов казеозного некроза на границе с прилегающим к зоне некроза валом эпителиоидных клеток и фиброзной стенкой каверны. Данная локализация микобактерий может натолкнуть на мысль о формировании ими биопленок, что может быть одним из объяснений возникновения лекарственной устойчивости, хотя этот вопрос и требует специального изучения.

Выводы

1. Проведенное исследование подтвердило, что микобактерии туберкулеза могут выявляться в тканях с помощью различных методов и иметь разную морфологию, при этом наличие даже небольшого числа кислотоустойчивых бактерий при окраске по Цилю—Нильсену является важным диагностическим признаком, но их отсутствие не свидетельствует об отсутствии туберкулеза.

2. При использовании всех бактериоскопических методов на светооптическом уровне на нашем материале внутриклеточных форм возбудителя не обнаружено.

3. Наибольшая доля атипичных морфологических форм микобактерий обнаруживается при флюоресцентном (35,62%) и ИГХ- исследованиях (42,71%), что демонстрирует их более высокую чувствительность, в то время как при окраске по Цилю—Нильсену атипичные микобактерии выявляются в сравнительно небольшом количестве (11,87%).

4. Микробиологическая сущность и клиническое значение морфологического полиморфизма микобактерий требуют дальнейшего изучения. Более того, можно утверждать, что в уточнении нуждается и патогенез туберкулеза.

Концепция и дизайн исследования — В.А.Ц., М.М.А.

Сбор и обработка материала — А.Н.О., М.М.А.

Статистическая обработка — М.М.А.

Написание текста — В.А.Ц., М.М.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Источник

Микобактерии – туберкулёза и лепры. Патогенность, иммунитет

» data-shape=»round» data-use-links data-color-scheme=»normal» data-direction=»horizontal» data-services=»messenger,vkontakte,facebook,odnoklassniki,telegram,twitter,viber,whatsapp,moimir,lj,blogger»>

Микобактерии

Род Mycobacterium (сем. Mycobacteriaceae, порядок Actinomycetales) включает более 100 видов, широко распространённых в природе. Большая часть – сапрофиты и условно-патогенные. У человека вызывают туберкулёз (Mycobacterium tuberculosis – в 92% случаев, Mycobacterium bovis – 5%, Mycobacterium africanus – 3%) и лепру (Mycobacterium leprae).

Микобактерии туберкулёза.

Mycobacterium tuberculosis – основной возбудитель туберкулёза у человека – был открыт в 1882 г. Р. Кохом.

Туберкулёз (tuberculosis, phthisis) – хроническое инфекционное заболевание. В зависимости от локализации патологического процесса выделяют туберкулёз органов дыхания и внелёгочные формы (туберкулёз кожи, костей и суставов, почек и др.). Локализация процесса в определённой степени зависит от путей проникновения микобактерий в организм человека и вида возбудителя.

Морфология, физиология. Микобактерии туберкулёза – грамположительные прямые или слегка изогнутые палочки 1-4 x 0.3-0.4 мкм. Высокое содержание липидов (40%) придаёт клеткам микобактерий туберкулёза ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, трудное восприятие анилиновых красителей (для окраски туберкулёзных палочек применяют метод Циля-Нильсена, по этому методу они окрашиваются в розовый цвет). В мокроте не может быть других кислотоустойчивых микроорганизмов, поэтому их обнаружение является указанием на возможный туберкулёз. В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зёрна Муха – шаровидные кислотоподатливые, легко окрашивающиеся по Граму (+). Возможен переход в фильтрующиеся и L-формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

Для размножения микобактерий туберкулёза в лабораторных условиях используют сложные питательные среды, содержащие яйца, глицерин, картофель, витамины. Стимулируют рост микобактерий аспарагиновая кислота, соли аммония, альбумин, глюкоза, твин-80. Чаще всего применяют среду Левенштейна-Йенсена (яичная среда с добавлением картофельной муки, глицерина и соли) и синтетическую среду Сотона (содержит аспарагин, глицерин, цитрат железа, фосфат калия). Размножаются микобактерии туберкулёза медленно. Велик период генерации – деление клеток в оптимальных условиях происходит 1 раз в 14-15 ч, тогда как большинство бактерий других родов делятся через 20-30 мин. Первые признаки роста можно обнаружить через 8-10 дней после посева. Затем (через 3-4 недели) на плотных средах появляются морщинистые, сухие с неровными краями колонии (напоминающие цветную капусту). В жидких средах сначала образуется нежная плёнка на поверхности, которая утолщается и падает на дно. Среда при этом остаётся прозрачной.

Являются облигатными аэробами (поселяются в верхушках лёгких с повышенной аэрацией). В среды добавляют бактериостатины (малахитовый или бриллиантовый зелёный) или пенициллин для подавления роста сопутствующей микрофлоры.

Признаки, которые используют при дифференциации Mycobacterium tuberculosis от некоторых других микобактерий, встречающихся в исследуемых материалах:

Обозначения: + – наличие признака, – – отсутствие признака, – признак непостоянен.

Антигены. Клетки микобактерий содержат соединения, белковые, полисахаридные и липидные компоненты которых обуславливают антигенные свойства. Антитела образуются на туберкулиновые протеиды, а также на полисахариды, фосфатиды, корд-фактор. Специфичность антител к полисахаридам, фосфатидам определяется в РСК, РНГА, преципитации в геле. Антигенный состав M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae и других микобактерий (включая многие сапротфитические виды) сходен. Туберкулиновый протеин (туберкулин) обладает выраженными аллергенными свойствами.

Резистентность. Попадая в окружающую среду, микобактерии туберкулёза длительное время сохраняют свою жизнеспособность. Так, в высохшей мокроте или пыли микроорганизмы выживают в течение нескольких недель, во влажной мокроте – 1.5 месяца, на предметах, окружающих больного (бельё, книги) – более 3 месяцев, в воде – более года; в почве – до 6 месяцев. Длительно сохраняются эти микроорганизмы в молочных продуктах.

К действию дезинфицирующих веществ микобактерии туберкулёза более устойчивы, чем другие бактерии, – требуются более высокие концентрации и более длительное время воздействия для их уничтожения (фенол 5% – до 6 часов). При кипячении погибают мгновенно, чувствительны к воздействию прямого солнечного света.

Экология, распространение и эпидемиология. Туберкулёзом в мире болеют 12 млн. человек, ещё 3 млн. заболевают ежегодно. В естественных условиях M. tuberculosis вызывает туберкулёз у человека, человекообразных обезьян. Из лабораторных животных высокочувствительными являются морские свинки, менее – кролики. К M. bovis – возбудителю туберкулёза у рогатого скота, свиней и человека – высокочувствительны кролики и менее – морские свинки. M. africanus вызывает туберкулёз у людей в странах тропической Африки.

Источником инфекции при туберкулёзе являются люди и животные с активно протекающим туберкулёзом, с наличием воспалительных и деструктивных изменений, выделяющие микобактерии (преимущественно лёгочные формы). Больной человек может инфицировать от 18 до 40 человек. Однократного контакта для заражения недостаточно (основное условие – продолжительный контакт). Для заражения также имеет значение степень восприимчивости.

Больной человек может за сутки выделить от 7 до 10 миллиардов микобактерий туберкулёза. Наиболее распространён воздушно-капельный путь заражения, при котором возбудитель проникает в организм черех верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки пищеварительного тракта (алиментарный путь) или через повреждённую кожу.

Патогенность. Микобактерии не синтезируют экзо- и эндотоксин. Поражение тканей вызывает ряд веществ микробной клетки. Так, патогенность возбудителей туберкулёза связана с прямым или иммунологически опосредованным повреждающим действием липидов (воском D, мураминдипептидом, фтионовыми кислотами, сульфатидами), которое проявляется при их разрушении. Их действие выражается в развитии специфических гранулём и поражении тканей. Токсическое действие оказывает гликолипид (трегалозодимиколат), так называемый корд-фактор. Он разрушает митохондрии клеток инфицированного организма, нарушает функцию дыхания, угнетает миграцию лейкоцитов в поражённый очаг. Микобактерии туберкулёза в культурах, имеющих корд-фактор, образуют извилистые тяжи.

Патогенез туберкулёза. Туберкулёз – хроническая гранулёматозная инфекция, может поражать любую ткань, по частоте у детей: лёгкие, лимфатические узлы, кости, суставы, мозговые оболочки; у взрослых: лёгкие, кишечник, почки.

Первичный туберкулёз (детский тип) – инфекция может продолжаться несколько недель. В зоне проникновения и размножения микобактерий возникает воспалительный очаг (первичный эффект – инфекционная гранулёма), наблюдается сесибилизация и специфический воспалительный процесс в регионарных лимфатических узлах (при поражении лёгких – грудные, глоточные лимфоидные скопления, миндалины) – формируется так называемый первичный туберкулёзный комплекс (как правило поражается нижняя доля правого лёгкого). Т. к. развивается состояние сенсибилизации, размножение в сенсибилизированном органе приводит к специфическим изменениям в ткани: микроорганизмы поглощаются макрофагами → вокруг них образуется барьер (фагосома) → лимфоциты атакуют эти клетки (выстраиваясь по периферии очага) → формируются специфические туберкулы (tuberculum – бугорок) – мелкие (диаметр 1-3 мм), зерновидные, белые или серовато-жёлтые. Внутри располагаются бактерии, затем ограничивающий пояс (гигантских или эпителиоидных) клеток, затем лимфоидные клетки, затем фиброидная ткань. Туберкулы могут сливаться в конгломераты → сдавление сосудов → нарушение кровообращения → некроз в центре конгломерата в виде сухих сыроподобных крошек (казеозный некроз). Может некротизироваться стенка сосуда → кровотечение.

Образовавшийся туберкул может:

● долго сохраняться (не сопровождается клиническими проявлениями);

● при доброкачественном течении болезни первичный очаг может рассасываться, поражённый участок рубцеваться (не нарушается функция органа) или кальцифицироваться (образуются очаги Гона, сохраняющиеся пожизненно без клинических проявлений). Однако этот процесс не завершается полным освобождением органима от возбудителя. В лимфатических узлах и других органах туберкулёзные бактерии сохраняются много лет, иногда в течение всей жизни. Такие люди, с одной стороны, обладают иммунитетом, а с другой – остаются инфицированными.

● Может происходить размягчение и инфильтрация первичного очага → это может сопровождаться прорывом очага в близлежащие ткани → может привести к разрыву бронха → некротизированная ткань проскальзывает в просвет бронха → образуется ложкообразная полость (caverna).

Если этот процесс происходит в кишечнике или на поверхности кожи, образуется туберкулёзная язва.

Хронический туберкулёз (взрослый тип) возникает в результате реинфекции (чаще эндогенной). Активация первичного комплекса развивается вследствие сниженной сопротивляемости организма, чему способствуют неблагоприятные условия быта и труда (плохое питание, низкая инсоляция и аэрация, малая подвижность), сахарный диабет, силикоз, пневмокониоз, физические и психические травмы, другие инфекционные заболевания, генетическая предрасположенность. У женщин большая вероятность перехода заболевания в хроническую форму. Активация первичного туберкулёзного комплекса ведёт к генерализации инфекционного процесса.

● Чаще всего лёгочная (верхняя и задняя часть верхней доли) с образованием каверн, в стенках каверн могут размножаться Staphylococcus и Streptococcus → изнурительная лихорадка; если эрозируются стенки сосудов → кровохарканье. Формируются рубцы. Иногда бывают осложнения: туберкулёзная пневмония (при внезапном разлитии экссудата из очага) и плеврит (если повреждённые участки лёгких близки к плевре). Поэтому всякий плеврит должен рассматриваться как туберкулёзный процесс, пока не будет доказано обратное.

● Инфекция может распространяться гематогенно и лимфогенно.

● Бактери могут распространяться в близлежащие ткани.

● Могут продвигаться по естественным путям (из почек в мочеточники).

● Могут распространяться по кожным покровам.

● Может развиться туберкулёзный сепсис (нагруженный микроорганизмами материал из туберкул попадает в крупный сосуд).

Диссеминация возбудителей приводит к образованию в различных органах туберкулёзных очагов, склонных к распаду. Выраженная интоксикация обусловливает тяжёлые клинические проявления болезни. Генерализация приводит к поражению органов мочеполовой системы, костей и суставов, мозговых оболочек, глаз.

Клиника зависит от локализации поражения, общим является длительное недомогание, быстрое утомление, слабость, потливость, похудание, по вечерам – субфибрильная температура. Если поражаются лёгкие – кашель, при деструкции лёгочных сосудов – кровь в мокроте.

Иммунитет. Заражение микобактериями туберкулёза не всегда приводит к развитию заболевания. Восприимчивость зависит от состояния макроорганизма. Она значительно усиливается, когда человек находится в неблагоприятных условиях, снижающих общую резистентность (изнурительный труд, недостаточное и неполноценное питание, плохие жилищные условия и т.д.). Способствует развитию туберкулёзного процесса и ряд эндогенных факторов: сахарный диабет; заболевания, которые лечат кортикостероидами; психические болезни, сопровождающиеся депрессией, и другие заболевания, снижающие резистентность организма. Значение образующихся в организме антител в формировании сопротивляемости к туберкулёзной инфекции до сих пор неясно. Считается, что антитела к микобактериям туберкулёза являются “свидетелями” иммунитета и не оказывают ингибирующего действия на возбудителя.

Большое значение имеет клеточный иммунитет. Показатели его изменений адекватны течению заболевания (по реакции бласттрансформации лимфоцитов, цитотоксическому действию лимфоцитов на клетки-“мишени”, содержащие антигены микобактерий, выраженности реакции торможения миграции макрофагов). T-лимфоциты после контакта с антигенами микобактерий синтезируют медиаторы клеточного иммунитета, усиливающие фагоцитарную активность макрофагов. При подавлении функции T-лимфоцитов (тимэктомия, введение антилимфоцитарных сывороток, других иммунодепрессантов) туберкулёзный процесс был быстротечным и тяжёлым.

Микробактерии туберкулёза разрушаются внутриклеточно в макрофагах. Фагоцитоз является одним из механизмов, приводящих к освобождению организма от микобактерий туберкулёза, но он часто является незавершённым.

Другим важным механизмом, способствующим ограничению размножения микобактерий, фиксации их в очагах, является образование инфекционных гранулём при участии T-лимфоцитов, макрофагов и других клеток. В этом проявляется защитная роль ГЗТ.

Иммунитет при туберкулёзе ранее называли нестерильным. Но имеет значение не только сохранение живых бактерий, поддерживающих повышенную сопротивляемость к суперинфекции, а и явление “иммунологической памяти”. При туберкулёзе развивается реакция ГЗТ.

Лабораторная диагностика туберкулёза осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим и биологическим методами. Иногда используются аллергологические пробы.

Бактериологический метод. В исследуемом материале обнаруживают микобактерии туберкулёза путём микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену и с применением люминесцентных красителей (чаще всего аурамина). Можно использовать центрифугирование, гомогенизацию, флотацию материала (гомогенизация суточной мокроты → добавление к гомогенату ксилола (или толуола) → ксилол всплывает, увлекая микобактерии → эту плёнку собирают на стекло → ксилол испаряется → получается мазок → окрашивание, микроскопирование). Бактериоскопию рассматривают как ориентировочный метод. Применяют ускоренные методы обнаружение микобактерий в посевах, например, по методу Прайса (микроколонии). Микроколонии позволяют увидеть и наличие корд-фактора (основной фактор вирулентности), благодаря которому образовавшие его бактерии складываются в косы, цепочки, жгуты.

Бактериологический метод является основным в лабораторной диагностике туберкулёза. Выделенные культуры идентифицируют (дифференцируют от других видов микобактерий), определяют чувствительность к антимикробным препаратам. Этот метод может использоваться для контроля за эффективностью лечения.

Серологические методы не применяются для диагностики, так как нет корреляции между содержанием антител и тяжестью процесса. Могут использоваться в научно-исследовательских работах.

Биологический метод используется в случаях, когда возбудителя трудно выделить из исследуемого материала (чаще всего при диагностике туберкулёза почек из мочи) и для определения вирулентности. Материалом от больного заражают лабораторных животных (морских свинок, чувствительных к M. tuberculosis, кроликов, восприимчивых к M. bovis). Наблюдение ведут в течение 1-2 месяцев до гибели животного. С 5-10-го дня можно исследовать пунктат лимфотического узла.

Аллергические пробы. Для проведения этих проб используется туберкулин – препарат из M. tuberculosis. Впервые это вещество получил Р. Кох в 1890 г. из кипячённых бактерий (“старый туберкулин”). Сейчас применяется очищенный от примесей и стандартизованный в ЕД туберкулин (PPD – очищенный протеиновый дериват). Это фильтрат убитых нагреванием бактерий, отмытый спиртом или эфиром, лиофильно-высушенный. С иммунологической точки зрения – гаптен, вступает в реакцию с иммуноглобулинами, фиксированными на T-лимфоцитах.

Проба Манту проводится внутрикожным введением туберкулина. Учёт результатов через 48-72 часа. Положительный результат – местная воспалительная реакция в виде отёка, инфильтрата (уплотнения) и покраснения – papula. Положительный результат свидетельствует о сенсибилизации (или о наличии микобактерий в организме). Сенсибилизация может быть вызвана инфицированием (реакция положительна через 6-15 недель после инфицирования), болезнью, иммунизацией (у привитых живой вакциной).

Ставится туберкулиновая проба с целью отбора для ревакцинации, а также для оценки течения туберкулёзного процесса. Имеет значение также вираж Манту: положительный (после отрицательной пробы положительная) – инфицирование, отрицательный (после положительной пробы отрицательная) – гибель микобактерий.

Профилактика и лечение. Для специфической профилактики используют живую вакцину БЦЖ – BCG (Bacille de Calmette et de Guerin). Штамм БЦЖ был получен А. Кальметтом и М. Жереном длительным пассированием туберкулёзных палочек (M. bovis) на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи. Ими было сделано 230 пересевов в течение 13 лет и получена культура со сниженной вирулентностью. В нашей стране в настоящее время проводят вакцинацию против туберкулёза всех новорождённых на 5-7-й день жизни внутрикожным методом (наружная поверхность верхней трети плеча), через 4-6 недель образуется инфильтрат – pustula (маленький рубчик). Микобактерии приживаются и обнаруживаются в организме от 3 до 11 месяцев. Вакцинация предохраняет от инфицирования дикими уличными штаммами в наиболее уязвимый период. Ревакцинацию проводят лицам с отрицательной туберкулиновой пробой с интервалом в 5-7 лет до 30-летнего возраста (в 1, 5-6, 10 классах школы). Создают таким образом инфекционный иммунитет, при котором возникает реакция ГЗТ.

Для лечения туберкулёза применяют антибиотики, химиотерапевтические препараты, к которым чувствительны возбудители. Это – препараты I ряда: тубазид, фтивазид, изониазид, дигидрострептомицин, ПАСК и II ряда: этионамид, циклосерин, канамицин, рифампицин, виомицин. Все противотуберкулёзные препараты действуют бактериостатически, к любому препарату быстро вырабатывается устойчивость (перекрёстная), поэтому для лечения проводят комбинированную терапию одновременно несколькими препаратами с разным механизмом действия, с частой сменой комплекса препаратов.

В комплексе лечебных мероприятий используется десенсибилизирующая терапия, а также стимуляция естественных защитных механизмов организма.

Возбудитель туберкулеза

1.Возбудитель туберкулеза — микобактерия, относится к семей­ству Micobacteriaceae. Различают туберкулезные микобактерии человеческого, бычьего и птичьего типов. Для человека они па­тогенны. Помимо патогенных для человека, в природе широко распространены сапрофитные микобактерии, или так называе­мые паратуберкулезные бациллы. Они содержатся в водопро­водной и сточной воде, в молоке и масле, на овощах и ягодах. Их обнаруживают на коже, в промывных водах желудка и глотки, они выделяются со слюной, мокротой, калом и мочой.

Морфологически они напоминают патогенные микобактерии, характеризуются кислотоустойчивостью. По этой причине воз­можны ошибки при распознавании природы микобактерии, а следовательно, и характера патологического процесса. Паратуберкулезные бациллы, в отличие от патогенных, не вызывают типичных изменений в организме людей и животных. Принад­лежность их к тому или другому виду устанавливается главным образом на основании их культуралъных свойств и результатов прививки морским свинкам.

Микобактерии туберкулеза (МБТ) были открыты Р. Кохом в мокроте больного туберкулезом. Человеческий тип туберкулез­ного возбудителя: палочки прямые или изогнутые длиной 1,5— 4 м толщиной 0,3—0,5 м. Величина палочек зависит от возраста микроба и условий его обитания. В тканях живого организма палочки могут удлиняться, что, по-видимому, зависит от за­медленного их деления. В казеозных массах палочки располага­ются неровными кучами по 2—3 и более. В различных условиях пребывания в организме палочки могут образовать нитевид­ные, ветвящиеся формы с булавовидными образованиями на концах нитей. Полиморфизм является характерным свойством микобактерии. Кислотоупорные МБТ обладают свойством медленно воспринимать анилиновые красители. Поэтому их окраска производится с применением протравы (карболовая кислота). При подогревании наиболее распространенные способы окраски следующие:

МБТ экзотоксина не выделяют. Однако фильтраты их культур на жидких питательных средах токсичны для животных, боль­ных туберкулезом, что связанно с выделением в среду эндо­токсина. МБТ выделяют также летучие токсины. Особенно­стью этих токсических веществ является их специфическое действие только на инфицированных и больных туберкулезом людей и животных.

2. Благодаря особому химическому строению микобактерии туберку­леза обладают значительной устойчивостью к физическим и хи­мическим агентам. Во влажной мокроте микобактерии выдер­живают нагревание в течение 30 мин при 75 “С, при кипячении погибают через 5 мин. В выделенной мокроте МВТ погибают при 100 “С через 45 мин. В мокроте, выделенной и сохраняе­мой в темноте при комнатой температуре, жизнеспособность палочек сохраняется не менее 4 мес, в рассеянном свете они погибают через 1—1,5 мес. В суховоздушной камере при ув­лажнении с температурой 80 °С МВТ выживают в течение 2 ч. В уличной пыли МВТ сохраняются до 10 дней, на страницах книг до 3 мес. В воде палочки выживают не менее 150 дней после заражения. МВТ выдерживают процессы гниения и мо­гут несколько месяцев сохраняться в погребенных трупах. Препараты хлора и йода хорошо действуют на микобактерии.

Лекарственно устойчивые или резистентные микобактерии по­являются у больных при антибактериальной химиотерапии, а иногда возникают и спонтанно (первичная устойчивость).

При испытании на лекарственную устойчивость следует поль­зоваться плотными питательными средами Гельберга, Петрань-яни, Герольда и жидкими — синтетической средой Сотона (с плазмой), кровяной средой или плазмой.

Лабораторная диагностика туберкулеза

1. Лабораторная диагностика туберкулеза используется для уста­новления специфической этиологии заболевания, подозрительного на туберкулез. Производят микробиологическое исследование материала от больных:

– пунктатов лимфатических узлов.

Исследование на возбудителя туберкулеза производят непо­средственно в доставленном материале бактериоскопическими, а кроме того, бактериологическими и биологическими метода­ми. При необходимости исследовать свежую мокроту делают мазки препарата на предметных стеклах, высушивают на воз­духе, фиксируют на пламени горелки. Затем препарат окраши­вают карболовым фуксином, промывают водой и обесцвечи­вают 15—25%-ным раствором серной кислоты, промывают и докрашивают водным раствором метиленового спирта. После подсыхания препарат подвергают иммерсионной микро­скопии, просматривают 100 полей зрения (практически весь препарат). Туберкулезные микобактерии визуализируются как ярко-красные, тонкие, изящные, в одиночку или группами, большей частью лежащие вне клеток палочки. В настоящее время имеет распространение метод флотации с последующей микроскопией. Промывные воды желудка бактериоскопически, дальнейшее исследование проводят так же, как и при исследо­вании мокроты. Мазок из гортани или зева окрашивают по Цилю-Нильсену. Мочу центрифугируют и готовят мазок из осадка мочи. Спинномозговую жидкость, взятую асептично, отстаивают сутки на холоде, после чего образуется тонкая фибринозная пленка (паутинка), в которой содержатся туберкулезные мико­бактерии. Делают мазок на предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют, окрашивают по Цилю-Нильсену. Если пле­ночка не образовалась, то исследованию подвергают отцен-трифугированный осадок.

Для обнаружения туберкулезных микобактерии применяется люминесцентная микроскопия, которая имеет ряд преимуществ перед прямой бактериоскопией в окрашенных препаратах. При люминесцентной микроскопии туберкулезные микобактерии светятся обычно золотисто-оранжевым светом на черном фоне (картина “звездного неба”); кислотоупорные сапрофиты — зе­леноватым с апельсиновым оттенком.

При исследовании спинномозговой жидкости методом люми­несцентной микроскопии положительные результаты можно получить в 12,5 раза чаще, чем при просмотре препаратов, ок­рашенных по Цилю-Нильсону.

2. Бактериологическое исследование. Методика бактериологиче­ского обнаружения туберкулезных микобактерии основана на их способности противостоять воздействию кислот и щелочей.

Туберкулезная бактерия после такой обработки остается впол­не жизнеспособной, что позволяет еще до посева материала избавиться от находящихся в нем посторонних микробов. Ми-кобактерии туберкулеза характеризуются некоторыми основ­ными свойствами, используемыми для их дифференцирования. Они неподвижны, растут только в животном организме или на питательных средах специального состава (обычно с глицери­ном и яичным желтком); на обычных питательных (МПА) сре­дах не растут. Оптимальная температура, при которой растут туберкулезные бактерии, равна 37 °С, хотя возможен рост в пределах от 30 до 42 °С. Для размножения микробов требуется длительное время: на искусственных питательных средах рост появляется только через 10-30 дней. Колонии микобактерий туберкулеза имеют своеобразный вид, отличающийся шерохо­ватостью (в виде плоских чешуек с возвышенным центром или розеток с углублением в центре), или же они могут быть глад­кими блестящими, похожими на капли. На жидких питатель­ных средах образуется толстая морщинистая пленка.

Обычно для посева наследуемого материала пользуются среда­ми Любенац или Петракины. Посев выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 3 мес, проверяя наличие роста каждую неделю. Наиболее часто рост наблюдается в сроки от

3 до 6 недель. Штаммы, выделенные от больных, леченных химиопрепаратами, вырастают в гораздо более поздние сроки (через 50—70—80 дней). В настоящее время предложены и ис­пытаны ускоренные методы выращивания культур туберкулез­ных микробов на препаратах – мазках (по Прайсу) и на кро­вяной среде.

Серологические исследования имеют относительное значение.

3. Биологическая проба является по праву наиболее рациональным диагностическим приемом. Материал может быть введен под кожу или в полость живота морским свинкам. При наличии в материале вирулентных туберкулезных микобактерий обычно на 10-12-й день в месте его введения под кожей образуется уплотнение, переходящее в дальнейшем в незаживающую язву. Свинки погибают от генерализованного туберкулеза через 2—

4 мес. Ускоренная биологическая проба: через регионарный лим­фатический узел морской свинки вводят несколько капель на­следуемого материала. На 8—10-й день увеличенный лимфатиче­ский узел вырезают и исследуют бактериоскопически в препара­тах-отпечатках на присутствие туберкулезных микобактерий.

Микобактерии лепры.

Возбудитель лепры (проказы) – Mycobacterium leprae описан Г. Гансеном в 1874 г. Лепра – хроническое инфекционное заболевание, встречающееся только у людей. Заболевание характеризуется генерализацией процесса, поражением кожи, слизистых оболочек, периферических нервов и внутренних органов.

Морфология, физиология. Микобактерии лепры – прямые или слегка изогнутые палочки длиной от 1 до 7 мкм, диаметром 0.2-0.5 мкм. В поражённых тканях микроорганизмы располагаются внутри клеток, образуя плотные шаровидные скопления – лепрозные шары, в которых бактерии тесно прилегают друг к другу боковыми поверхностями (“сигаретные палочки”). Кислотоустойчивы, окрашиваются по методу Циля-Нильсена в красный цвет.

На искусственных питательных средах микобактерии лепры не культивируются. В 1960 г. была создана экспериментальная модель с заражением белых мышей в подушечки лапок, а в 1971 г. – броненосцев, у которых в месте введения микобактерий лепры образуются типичные гранулёмы (лепромы), а при внутривенном заражении развивается генерализованный процесс с размножением микобактерий в поражённых тканях.

Антигены. Из экстракта лепромы выделены 2 антигена: термостабильный полисахаридный (групповой для микобактерий) и термолабильный белковый, высокоспецифичный для лепрозных палочек.

Экология и распространение. Естественным резервуаром и источником возбудителя лепры является больной человек. Заражение происходит при длительном и тесном контакте с больным.

Свойства возбудителя, его отношение к воздействию различных факторов окружающей среды изучены недостаточно.

Патогенность возбудителя и патогенез лепры. Инкубационный период лепры в среднем 3-5 лет, но возможно удлинение до 20-30 лет. Развитие заболевания происходит медленно, в течение многих лет. Различают несколько клинических форм, из которых наиболее тяжёлая и эпидемически опасная – лепроматозная: на лице, предплечьях, голени образуются множественные инфильтраты-лепромы, в которых содержится огромное количество возбудителей. В дальнейшем лепромы распадаются, образуются медленно заживающие язвы. Поражаются кожа, слизистые оболочки, лимфатические узлы, нервные стволы, внутренние органы. Другая форма – туберкулоидная – протекает клинически легче и менее опасна для окружающих. При этой форме поражается кожа, а нервные стволы и внутренние органы реже. Высыпания на коже в виде мелких папул сопровождаются анестезией. В очагах поражений возбудителей бывает немного.

Иммунитет. В течение развития заболевания возникают резкие изменения иммунокомпетентных клеток, главным образом T-системы, – снижается число и активность T-лимфоцитов и как следствие теряется способность реагировать на антигены микобактерий лепры. Реакция Мицуды на введение в кожу лепромина у больных лепроматозной формой, протекающей на фоне глубокого угнетения клеточного иммунитета, отрицательна. У здоровых лиц и у больных туберкулоидной формой лепры – положительна. Эта прба, таким образом, отражает тяжесть поражения T-лимфоцитов и используется как прогностическая, характеризующая эффект лечения. Гуморальный иммунитет не нарушается. В крови больных обнаруживаются в высоких титрах антитела к микобактериям лепры, но они, по-видимому, не играют защитной роли.

Лабораторная диагностика. Бактериоскопическим методом, исследуя соскобы с поражённых участков кожи, слизистых оболочек, обнаруживают характерно располагающиеся микобактерии лепры типичной формы. Мазки окрашивают по Цилю-Нильсену. Других способов лабораторной диагностики в настоящее время нет.

Профилактика и лечение. Специфической профилактики лепры нет. Комплекс предупредительных мероприятий проводят противолепрозные учреждения. Больных лепрой лечат в лепрозориях до клинического выздоровления, а затем амбулаторно.

В нашей стране лепру регистрируют редко. Отдельные случаи бывают лишь в некоторых районах. По данным ВОЗ, в мире насчитывается более 10 млн. больных лепрой.

Лечение лепры проводят сульфоновыми препаратами (диацетилсульфон, селюсульфон и др.). Используют и десенсибилизирующие средства, препараты, применяемые для лечения туберкулёза, а также биостимуляторы. Разрабатываются методы иммунотерапии.

Возбудитель проказы

1. Проказа — заболевание, вызываемое микробом рода микобак-терий — Micobacterium leprae (палочка Хансена). Различают следующие клинические формы болезни:

Лепроматозная (узловая) форма характеризуется разрастанием в слизистых оболочках и в коже грануляционной ткани, состав­ляющей основу так называемых лепром, в последних имеется значительное количество кислотоупорных микобактерий в ко­же, лимфатических узлах, слизи носа, зева. Морфология и биология лепры: возбудитель проказы по морфо­логии сходен с туберкулезной палочкой. Это прямая или слег­ка изогнутая микобактерия, сплошная или зернистая, которая легче, чем туберкулезная, окрашивается фуксином (без подог­ревания) и легче обесцвечивается кислотами и щелочами. Грамположительна. В лепрозных узлах (лепромах) палочки Хансена встречаются в громадном количестве, лежат значи­тельными скоплениями в виде “связок сигар”.

Многократные попытки выращивания микробактерии проказы на питательных средах заставляют сомневаться в возможности получения культур микробактерий лепры вне тканей человека. На глицериновом плацентарном агаре возбудители лепры мед­ленно растут в виде складчатого или влажного налета или пленки, бульон равномерно мутнеет.

Биологическую пробу нельзя воспроизвести – эксперименталь­ные животные невосприимчивы к лепре.

По характеру бактерии выделенных культур можно разделить на 3 типа:

• кислотоустойчивые микробактерии, непатогенные для всех ви­дов животных;

• кислотоустойчивые микробактерии, растущие только в пер­вичной культуре;

• микробактерии некислото- и слабокислотоустойчивые.

2. Микроскопическое исследование. Диагноз ставят на основании бактериоскопического исследования слизи из носа или ткане­вой жидкости из кожных поражений. Положительные находки подкрепляют диагноз. При отрицательном результате делают биопсию пораженных участков и производят исследования от­печатков их или гистологических срезов.

В лепрозных поражениях имеются очень характерные “лепроз-ные клетки”, овальные или круглые, заполненные кислото­устойчивыми бактериями. Большие сильно раздутые клетки с бактериями носят название “ггпрозных шаров”. Гигантские клетки в лепромах не обнаруживаются.

Лепрозные микробактерии приходится дифференцировать с ту­беркулезными на основании более легкой окрашиваемости ле­прозных микробактерий и более легкой их обесцвечиваемости спиртом и кислотами после окраски. Одним из наиболее упот­ребляемых является способ Баумгартена — окрашивают мазок фуксином без подогревания, обесцвечивают в течение 30 мин в азотнокислом спирте, промывают в воде и докрашивают вод­ным раствором метиленового синего. Срезы лепром окраши­вают в том же растворе фуксина в течение 12—15 мин, обес­цвечивают полминуты в азотнокислом спирте, промывают в воде и докрашивают метиленовым синим. В старых лепромах палочки лепры окрашены в красный цвет; в свежих поражениях микробактерии частью синие, частью красные. Туберкулез­ные микобактерии этим методом обычно не прокрашиваются. Аллергическая реакция: для подтверждения диагноза проказы применяют аллергическую пробу с лепромином (реакция Мит-суда). Лепромин приготовляют из биопсированных тканей больных проказой. Через 8—24 ч после введения в кожу лепромина развивается инфильтрат с гиперемией. Однако проба Мит-суда недостаточно специфична, хотя и очень распространена.

Источник